Deneysel testis torsiyonu modeline ceratonia siliqua etkisinin ışık ve elektron mikroskobu düzeyinde araştırılması

Abstract

Testis torsiyonu genellikle adolesanlarda ortaya çıkan, testiküler fonksiyon kaybı ile sonuçlanabilen bir ürolojik acildir. Cerrahi müdahaleyle detorsiyone edilen testislerde reperfüzyona bağlı hasar ortaya çıkabilmektedir. Torsiyon sırasında arteriyel kan akımının bozulması sonucu iskemik hasar oluşurken; detorsiyondan sonra reperfüzyon sağlanır ancak artan serbest oksijen radikalleri dokuda oksidatif hasar oluşturur. C.siliqua'nın çeşitli infertilite modeli uygulanan sıçanlarda sperm sayısında artışa, hormonal parametrelerde düzelmeye neden olduğu, oksidatif stresi azalttığı bilinmektedir. Çalışmamızın amacı C.siliqua destek tedavisinin iskemi/reperfüzyon hasarına karşı koruyucu etkisini araştırmaktır. 8 haftalık Wistar albino sıçanlar kontrol (n=7), C.siliqua enjeksiyonu yapılan grup (n=7), testis torsiyon/detorsiyon modeli ile hasar oluşturulan grup (n=7) ve hasarı sonrası 1 hafta intraperitoneal C.siliqua enjeksiyonu uygulanan grup (n=7) olarak 4 gruba ayrılmıştır. 1 hafta sonra sakrifiye edilen hayvanların testisleri ışık mikroskobik, geçirimli elektron mikroskobik incelemeler için takip edilmiş ve biyokimyasal incelemelerde kullanılmıştır. Morfolojik inceleme için Hematoksilen-Eozin ve Masson-Trikrom boyamaları yapılıp Johnsen skoru yapılmıştır. İmmünohistokimyasal yöntemle CD68, kaspaz-3, HIF-1??, SOD ve Katalaz antikorları ile işaretlenip, semikantitatif ve kantitatif yöntemlerle değerlendirilmiştir. TEM ile ultrastrüktürel inceleme yapılmıştır. Dokuda GSH, MDA, ROS, AOPP ve FRAP ölçülmüş; serum örneklerinde ELISA yöntemiyle testosteron, AMH ve inhibin-B düzeyleri belirlenmiştir. Işık mikroskobu ile histopatolojik değerlendirmede İ/R grubunda izlenen apoptotik, nekrotik değişikliklerin İ/R+C.siliqua grubunda daha az olduğu görüldü. İ/R+C.siliqua grubunun morfolojisinin İ/R grubuna göre daha iyi korunduğu bulundu (p<0.0001). İ/R grubundaki apoptoz, C.siliqua tedavisi alan gruptan daha fazlaydı (p= 0.0390). Antioksidan enzimlerden SOD ve Katalazın immünohistokimya boyamalarında İ/R grubunda düşük bulunan ekspresyon seviyelerinin tedavi alan grupta daha yüksek olduğu saptandı (p=0.0385, p=0.0490). Ultrastrüktürel olarak İ/R grubunda mitokondri kristalarının silindiği, hücreler arası ödem ve hücrelerde vakuolizasyon olduğu, interstisyel alanda makrofaj, eritrosit varlığı izlendi ve Leydig hücre hasarı görüldü. İ/R+C.siliqua grubunda mitokondri kristalarının korunduğu, genel yapının ve Leydig hücre yapısının kontrole yakın olduğu izlendi. Biyokimyasal incelemede İ/R grubuna kıyasla İ/R+C.siliqua grubunda GSH ve FRAP seviyeleri anlamlı olarak yüksekti (p=0.0254, p<0.0001), ROS seviyeleri düşüktü (p=0.0463). Serum inhibin-B seviyeleri İ/R grubunda kontrole göre azdı (p=0.0018); ancak tedavi ile anlamlı fark saptanmadı (p=0.8288). C.siliqua İ/R kaynaklı yapısal ve ince yapısal hasarı azaltmıştır. Apoptoz C.siliqua tedavisinden sonra daha az gözlenmiş; oksidatif stresi gösteren belirteçlerden SOD, Katalaz, GSH, FRAP'ta fark izlenmiştir. C.siliqua'nın testosteron ve diğer hormonlar üzerine etkisi saptanmamıştır ancak Leydig hücre hasarında tedavi ve hasar grubu arasında fark ince yapısal olarak görülmüştür. C.siliqua'nın içeriğindeki flavonoidler ve polifenollerin tedavi edici etkisi gelecekteki çalışmaların konusu olarak düşünülebilir. C.siliqua'nın sıçan modelinde iskemi/reperfüzyon hasarına karşı etkin olduğu bulunmuş, insanda ileri çalışmaların denenebileceği sonucuna ulaşılmıştır.

Testicular torsion is a urological emergency that usually occurs in adolescents and has the risk of resulting in loss of testicular function. Damage due to reperfusion may occur in testicles detorsioned by surgical intervention. While ischemia-induced damage occurs as a result of disruption of arterial blood flow during twisting; reperfusion was achieved after detorsion, but increased free oxygen radicals cause oxidative damage to the tissue. It has been reported that C.siliqua causes an increase in sperm parameters, improve hormone levels and decrease oxidative stress in infertility models of rat. The aim of our study is to investigate the protective effect of C.siliqua against ischemia/reperfusion (I/R) injury. 8-week-old Wistar albino rats were divided into four groups as follows: control (n=7), group injected with C. siliqua only (n=7), group damaged by testicular torsion/detorsion model (n=7) and group that received IP C.siliqua injection for a week after T/D model(n=7). Animals were sacrificed after 1 week and their testes were followed for light microscope, transmission electron microscope and used for biochemical examinations. Hematoxylin-Eosin and Masson-Trichrome stainings were performed, and morphological examination and Johnsen score were performed. Immunohistochemically Caspase-3, HIF-1??, CD68, SOD and Catalase antibodies were marked and evaluated semiquantitatively and quantitatively. Ultrastructural evaluations were made with TEM. For biochemical examinations, GSH, MDA, ROS, AOPP and FRAP were examined in the tissue; testosterone, AMH and inhibin-B levels were determined in serum samples by ELISA method. In histopathological evaluation by light microscopy, apoptotic and necrotic changes observed in the I/R group were observed to be less in the I/R+C.siliqua group. It was found that the morphology of the I/R+C.siliqua group was better preserved than the I/R group (p<0.0001). Apoptosis in the I/R group was higher than in the group receiving C.siliqua treatment (p = 0.0390). ). In immunohistochemistry staining of antioxidant enzymes SOD and Catalase, it was determined that the expression levels, which were low in the I/R group, were higher in the treatment group (p = 0.0385, p = 0.0490, respectively). Ultrastructurally, in the I/R group, mitochondrial crista were erased, intercellular edema and vacuolization were observed, the presence of macrophages and erythrocytes in the interstitial area was observed, and Leydig cell damage was seen. It was noticed that in the I/R+C.siliqua group, mitochondrial cristae were preserved and the general structure and Leydig cell structure were close to the control In biochemical examination, GSH and FRAP levels were significantly higher in the I/R+C.siliqua group compared to the I/R group (p=0.0254, p<0.0001, respectively) and ROS levels were lower (p=0.0463). Serum inhibin-B levels were lower in the I/R group compared to the control (p = 0.0018); however, no significant difference was detected with treatment (p = 0.8288). C.siliqua reduced I/R-induced structural and ultrastructural damage. Apoptosis was observed less after C.siliqua treatment; differences were observed in SOD, Catalase, GSH and FRAP, which are markers indicating oxidative stress. The effect of C.siliqua on testosterone and other hormones was not determined but Leydig cell damage difference was seen ultrastructurally between I/R and I/R+C.siliqua groups. The therapeutic effects of flavonoids and polyphenols contained in C.siliqua can be considered as the subject of future studies. It was found that C.siliqua was effective against I/R injury in the rat model, and it was concluded that further studies could be tried in humans.