Hızlı DNA analizi için iz-aşındırma yöntemi kullanılarak nanopor sensor hazırlanması ve karakteriz asyönü

Abstract

Nanopor sensörler 1970`li yıllarda kullanılmaya başlanan coulter sayacı (coulter-counter) temeline dayanır. Mikron büyüklüğündeki bir açıklıktan geçen parçacık veya hücrelerin sayılmasını sağlayan bu yöntem ilerleyen teknoloji ile daha küçük örneklerin analizi için kullanılmaya başlanmış ve 90`ların sonuna doğru mikron büyüklüğündeki açıklık nanopor seviyesine kadar indirilmiştir. Bu minyatürazyon sonrasında moleküler seviyede ve tek molekül hassasiyetinde analiz yapmak mümkün olmuştur. Hagan Bayley1 öncülüğünde başlayan bu teknik lipit membran içerisine yerleştirilen biyolojik bir nanoporun iki tarafının çözelti ile doldurulması ve elektriksel potansiyel altında iyonik bir akım oluşturulması temeline dayanmaktadır. Akım çok küçük değerlerde olup (pikoamper-nanoamper), çok sık aralıklarla ölçülmektedir. Tayin edilmek istenen molekülün çözeltiye eklenmesiyle moleküller yükleri gereği karşıt elektrota doğru hareketlenirler ve bu esnada nanopordan geçerler. Bu geçiş çok kısa akım düşmelerine (sinyal) sebep olur. Bu sinyallerin sıklığı molekülün konsantrasyonuyla doğru orantılı olup şekli molekülün yapısı hakkında fikir vermektedir. Bu yöntem literatürde dirençli-darbe (resistive-pulse) sensör veya stokastik sensor (stochastic sensor) olarak adlandırılmaktadır. Ayrıca bu yöntem ile çok çeşitli moleküller analizi edilmiştir ve genişlemiş ve günümüzde elektrokimyasal yöntem olarak kullanılmaya başlanmıştır2. Ancak analiz edilmek istenen molekülün biyolojik nanoporun boyutları ile sınırlı olması ve lipit membranın pH, potansiyel ve tuz konsantrasyonu gibi değişkenlere karşı dayanıklı olmaması biyolojik nanoporların kullanımını kısıtlamaktadır. Bu sebepten yapay nanoporlar yapılmaya başlanmış ve çeşitli teknikleri geliştirilmiştir. Bu teknikler genellikle ileri teknoloji, maliyetli ekipmanlar ve bu ekipmanları kullanacak tecrübeli iş gücü gerektirmektedir. İz-aşındırma (track-etch) yöntemi yapay nanopor üretilmesi için geliştirilen yöntemlerden biri olup diğer yöntemlere göre daha kolay ve ucuzdur. İz-aşındırma yöntemi hızlandırılmış iyonların ince membranlar (filmler) içerisinden geçerek (irradiation-ışınlama) oluşturdukları izlerin (hasarlı bölgelerin) kimyasallar yöntemlerle aşındırılması temeline dayanır. Aşındırma işlemi sonrası kullanılan membran (film) boyunca istenilen boyutlarda nanoporlar oluşur. Bu membranların nanopor yoğunluğu 1 iyon/membran-109 iyon/cm2 arasında ayarlanabilir. 1 iyon/membran yoğunluğundaki membranlar sensör uygulamaları için kullanılabilmektedir. İz-aşındırma yöntemi kullanarak yapılan çalışmalarda protein ve DNA tayini yapılmıştır. Diğer nanopor hazırlama yöntemleri iz aşındırma yöntemine kıyasla daha pahalı altyapı gerektirmekte ve yetişmiş eleman ihtiyacı gerektirmektedir. İz-aşındırma yöntemi ile nanopor hazırlanması kolay ve hızlıdır. Literatürde iz-aşındırma yöntemi kullanarak hazırlanan nanoporlar ile yapılan çalışmalarda sınırlı sayıda DNA analizi yapılmıştır. Bu çalışmalardan biri doktora sürecinde benim yaptığım çalışmadır. Bu çalışmada hazırlanan nanoporlar başarı ile karakterize edildikten sonra 50 ve 100 bazlık DNA zincirleri tayin edilmiş ve farklı uzunluktaki zincirlerin birbirinden ayrıştırılması gösterilmiştir3. Nanopor tabanlı sensörlerin hassas ve hızlı bir teknik olması farklı uygulamalar bulmasını sağlamıştır. Bunların içinde en çok dikkat çeken ise DNA analizdir. Öncelikle DNA zincirinin tayini ve tespit sınırı ardından zincir uzunluğu (molekül ağırlığına) göre analiz edilebilmesi nanopor sensörlerin günümüzde DNA sekanslama için kullanılan tekniklere alternatif olmasını sağlamıştır. Hızlı bir şekilde yapılan DNA analizleri (DNA sekanslama-sequencing) değişik türlerin gen haritalarının çıkartılması çalışmalara hız kazandıracak ve temel bilimsel araştırmalar, klinik tıp, tarımsal-endüstriyel biyoteknoloji, adli tıp gibi alanlarda yeni çalışmaların önünü açacaktır. Bu proje çerçevesinde iz-aşındırma yöntemi ile nanopor membranlar hazırlanıp farklı sekanslara sahip DNA zincirlerinin tayini ve zincirler arasındaki sekans farklılıklarının gösterilmesidir. Bu proje çerçevesinde DNA zincirlerinin tespit/tayini, molekül ağırlığına göre analiz edilmesi ve belirlenen zincirlerin baz dizilimi (sekansı) tayin edilecektir. Proje sonucunda hızlı ve hassas DNA analizi yapılabilecek sensör platformu hazırlanmış ve karakterize edilecektir. Projenin Amacı Bu projenin amacı hızlı ve hassas DNA analizi yapmak için yeni nesil nanopor tabanlı sensör hazırlanmasıdır. Proje çerçevesinde iz-aşındırma (track-etch) yöntemi kullanarak nanopor membranlar hazırlanacaktır. Bu membranlar yalnızca bir nanopor içerecek ve DNA zincirinin geçebileceği genişlikte olacaktır. Projenin temel amaçları;  İz-aşındırma yöntemi ile hazırlanan nanopor membranlar (koni şeklinde) kullanarak farklı molekül ağırlığındaki (uzunluktaki) DNA zincirlerinin tayin edilmesi, tayin-tespit sınırlarının belirlenmesi, DNA zincirlerinin tayini sırasında yarattıkları sinyallere (akım düşmesi ve süresi) bağlı olarak molekül ağırlıklarına göre karakterize edilmesi. DNA moleküllerinin geçişleri esnasında sebep oldukları sinyal farklılıklarının ve geçiş dinamiklerinin analizi (bkz. Şekil 5,12). Projenin bu kısmında yalnızca DNA zincirlerinin uzunluklarına göre analizi yapıldıktan sonra zincirin sekansına (baz dizilimine) özgü tayinler yapılarak yöntemin hassasiyeti ve uygulamaya dönük potansiyelinin göstermek.  Koni şeklinde hazırlanan nanoporlar dışında farklı geometrilerde nanoporlar hazırlayarak bu geometrilerin DNA molekulerinin tayin/tespit sınırlarına ve akim degerindeki gürültü miktarına etkisi incelemek. İz-aşındırma yöntemi kullanarak hazırlanan nanopor membranların farklı pH, elektrolit konsantrasyonlari ve sıcaklikta DNA zincirinin tayin/tespitine ve tekniğin hassasiyeti üzerine etkilerinin incelenmesi.