Tek Basamaklı Ters Transkripsiyon Kantitatif PZRYönteminin miRNA Ekspresyon Analizleri içinOptimizasyonu

Abstract

Amaç: Bu çalışmada mikroRNA (miRNA) hedeflerinin spesifik olarak belirlenmesi ve ekspresyon ölçümünün yapılmasına yönelik tek basamaklı ters transkripsiyon kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPZR) yönteminin, seçilen iki farklı miRNA (hsa-miR-145-5p ve hsa-miR-146a-5p) için araştırılması ve sürecin optimizasyonu amaçlanmıştır.Gereç ve Yöntem: RNA eldesi HEK293T hücre hattından yapılmıştır. Çalışmada seçilen her iki miRNA hedefi için uygun primerler tasarlanmış, tek basamaklı RT-qPZR yöntemi ile optimizasyon işlemi gerçekleştirilmiştir. Hedef amplikonların spesifiklik doğrulamaları agaroz jel elektroforezi ve konvansiyonel dizileme yöntemi ile gerçekleştirilmiştir. Bulgular: Tek basamakta gerçekleştirilen RT-qPZR çalışmasının her iki primer için de yüksek spesifiklikte ve hassasiyette sonuç verdiği qPZR erime eğrisi analizi ve agaroz jel görüntüleme sistemi ile gösterilmiştir. qPZR sırasındaki bağlanma sıcaklıklarından en düşük Ct değerinin 54°C’de elde edildiği görülmüştür. Ayrıca konvansiyonel Sanger dizileme sonucunda yalnızca ilgili miRNA dizilerinin hedeflendiği ve spesifik olmayan herhangi bir çoğaltma işleminin olmadığı gösterilmiştir.Sonuç: Sunulan çalışmada deneysel tasarım her iki miRNA hedefi için de optimize edilerek spesifik olarak yalnızca hedef miRNA molekülünün tespitinin yapılabildiği gösterilmiştir. Bu yaklaşım, ilerleyen çalışmalarda miRNA tespit ve ekspresyon analizlerinde güvenilir olarak kullanılabilecektir. Sunulan yaklaşım, düşük maliyetli, zamandan ve iş gücünden tasarruf sağlayan bir alternatif olması sebebiyle benzer tüm çalışmalarda değerlendirilebilir.