Ratlarda renal iskemi-reperfüzyon hasarında sitratın önkoşullayıcı etkisinin histopatolojik yöntemler ve oksidatif stres parametreleri ile değerlendirilmesi

Abstract

Amaç: Sitratın sıçanlarda böbrek iskemi-reperfüzyon hasarı üzerindeki önkoşullayıcı etkisini total oksidan/antioksidan seviyeleri, tiyol/disülfit dengesi, paraoksonaz-1 enzim seviyesi, iskemi modifiye albümin düzeyleri gibi biyokimyasal yöntemler ve histopatolojik yöntemlerle değerlendirmeyi amaçladık. Metot: Çalışmamızda ağırlıkları 285-370 g arasında değişen toplam 24 adet erişkin Wistar-Albino cinsi erkek sıçan kullanıldı. Tüm sıçanlara genel anestezi uygulandıktan sonra trakeostomi açılıp invazif mekanik ventilasyon uygulandı. Tüm gruplarda çalışma süresince arteryel basınç değerleri ve kalp atım hızı sayısı femoral artere yerleştirilen kateter ile ölçülerek kaydedildi. Sıçanlar kapalı zarf usulü ile 4 gruba ayrıldı. Sham operasyon grubuna (Grup S) laparotomi uygulandıktan sonra kan örneği alınıp böbrekleri çıkartıldı. İskemi-reperfüzyon grubunun (Grup İR) bilateral renal pediküllerinden klemplenerek böbrekleri 40 dk. boyunca iskemiye maruz bırakıldı. Daha sonra klempler kaldırılarak 60 dk. reperfüze edildi. Sitrat grubuna (Grup C) bir kuyruk veninden 90 dk. süresince %4'lük sodyum sitrat solüsyonundan 1 mmol/kg/saat dozunda, diğer kuyruk veninden ise %10'luk kalsiyum glukonat solüsyonundan 2 ml/kg/saat dozunda uygulandı. İskemireperfüzyon + sitrat grubuna (Grup İR+C) kuyruk venlerinden 60 dk. boyunca %4'lük sodyum sitrat 1 mmol/kg/saat dozunda ve %10'luk kalsiyum glukonat 2 ml/kg/saat dozunda infüzyon şeklinde uygulandı. İnfüzyonların durdurulmasının ardından böbrekler 40 dk. boyunca klemplendi. İskemi sonrası klempler kaldırıldı ve böbrekler 60 dk. reperfüze edildi. Reperfüzyonun ilk 30 dakikasında sodyum sitrat ve kalsiyum infüzyonları aynı dozlarda tekrar uygulandı. Çalışma sonunda tüm gruplarda çıkartılan böbrekler %10'luk nötral formaldehit solüsyonunda fikse edildi. Böbrek spesmenleri hematoksilen-eosin ile boyandıktan sonra histopatolojik olarak incelendi. İntersitisyel alanlarda kapiller vazodilatasyon/ konjesyon, tübüllerde dilatasyon / cast formasyonu, tübül epitelinde fırçamsı kenar kaybı, vakuolizasyon, epitelin lümene dökülmesi, intersitisyel yapıda inflamasyon / fibrozis varlığı, glomerüllerde morfolojik değişiklikler değerlendirilerek skorlandı. Biyokimyasal olarak serumdan üre, kreatin, total oksidan seviye, total antioksidan seviye, oksidatif stres indeksi, total tiyol ile native tiyol seviyeleri, tiyol-disülfit oranı, paraoksonaz-1 seviyesi, iskemi modifiye albümin seviyesi ölçüldü. Çalışma verilerinin istatistiksel analizinde (SPSS versiyon 20) Mann-Whitney U testi, Kruskal-Wallis testi, Dunn testi, Wilcoxon işaretli sıralar testi, Friedman testi ve Pearson ki-kare testi kullanıldı. Bulgular: Grupların başlangıçta arteryel hattan alınan kan örneklerinden çalışılan kan gazı parametrelerinin karşılaştırılmasında fizyolojik sınırlar içerinde sonuca etkisinin olacağı düşünülmeyen değerler dışında istatistiksel olarak farklılık saptanmadı. Grup İR'de başlangıçtaki, iskemi sonrası 40.dakikadaki, reperfüzyon 70.dakikadaki ve reperfüzyon 100.dakikadaki klor değerleri (p=0.02) ve kalsiyum (p=0.03) değerleri arasında istatistiksel olarak anlamlı fark saptandı. Grup C'nin başlangıçtaki HCO3 düzeyi ile sitrat infüzyonu 90.dakikadaki HCO3 düzeyi arasında istatistiksel olarak anlamlı fark görüldü (p=0.04). Grup C'nin başlangıçtaki Ca düzeyi ile sitrat infüzyonu 90.dakikadaki Ca düzeyi arasında istatistiksel olarak anlamlı fark saptandı (p=0.03). Grup İR+C'nin başlangıçtaki, sitrat infüzyonu sonrası 60.dakikadaki, iskemi sonrası 100.dakikadaki, reperfüzyon 130.dakika ve reperfüzyon 160.dakikadaki Cl değerleri arasında (p=0.009), Ca değerleri arasında (p=0.002), laktat değerleri arasında (p=0.01), glukoz değerleri arasında (p=0.008), HCO3 değerleri arasında (p<0.001) ve BE değerleri arasında (p=0.004) istatistiksel olarak anlamlı fark saptandı. Dört çalışma grubunun kreatin düzeyleri arasında (p<0.001) ve üre düzeyleri arasında (p<0.001) istatistiksel olarak anlamlı fark gözlemlendi. Grupların histopatolojik skorları arasında istatistiksel olarak anlamlı fark görüldü (p=0.001). TOS düzeyleri arasında (p=0.048) ve TAS düzeyleri arasında (p=0.016) istatistiksel olarak anlamlı fark görülürken OSİ değerleri arasında anlamlı fark görülmedi. T-Tiyol düzeyleri (p=0.002) ve N-Tiyol düzeyleri açısından istatistiksel olarak anlamlı fark (p<0.001) olduğu saptandı. Tiyol/disülfit düzeyleri karşılaştırıldığında sonuç istatistiksel olarak anlamlı görüldü (p<0.001). Gruplar arasında PON-1 düzeyleri (p<0.001) ve İMA düzeyleri açısından istatistiksel olarak anlamlı fark olduğu tespit edildi (p=0.001). Sonuç: Çalışmamızda böbreklerde oluşturduğumuz İR hasarının oksidatif hasara yol açtığını gözlemledik. Sodyum sitrat infüzyon uygulaması oksidatif hasarı TAS seviyesini artırıp TOS seviyesini azaltarak hafifletmiştir ve tiyol/disülfit dengesine tiyoller yönünde olumlu katkıda bulunmuştur. Histopatolojik incelemelerde sitratın önkoşullayıcı etkisinin böbreği İR hasarından koruduğunu gözlemledik. Sonuç olarak sitratın, böbrek İR hasarının olumsuz etkilerini azaltmada faydalı olabileceği kanısındayız.Aim: We aimed to investigate the preconditioning effect of citrate on kidney ischemia-reperfusion injury in rats by biochemical methods such as total oxidant/antioxidant levels, thiol/disulfide balance, paraoxonase-1 enzyme level, ischemia modified albumin levels and by histopathological methods. Materials and Methods: A total of 24 adult male Wistar-Albino rats weighing between 285-370 g were used in our study. After general anesthesia, tracheostomy was opened and invasive mechanical ventilation was applied to all rats. In all groups, arterial pressure and heart rate were measured and recorded with a catheter placed in the femoral artery. The rats were divided into 4 groups by closed envelope method. In the sham operation group (Group S), blood samples were taken after laparotomy and the kidneys were removed. In the ischemia-reperfusion group (Group IR), bilateral renal pedicles were clamped and the kidneys were exposed to ischemia for 40 minutes. Then the clamps were removed and reperfused for 60 min. Citrate group (Group C) was administered 4% sodium citrate solution at a dose of 1 mmol/kg/hour from one tail vein and 10% calcium gluconate solution at a dose of 2 ml/kg/hour from the other tail vein for 90 min. In the ischemia-reperfusion + citrate group (Group IR+C), 4% sodium citrate was infused at a dose of 1 mmol/kg/hour and 10% calcium gluconate at a dose of 2 ml/kg/hour through the tail veins for 60 min. After the infusions were stopped, the kidneys were clamped for 40 min. After ischemia, the clamps were removed and the kidneys were reperfused for 60 min. In the first 30 minutes of reperfusion, sodium citrate and calcium infusions were reapplied at the same doses. At the end of the study, the removed kidneys in all groups were fixed in 10% neutral formaldehyde solution. Kidney specimens were stained with hematoxylineosin and examined histopathologically. Capillary vasodilatation / congestion in interstitial areas, dilatation / cast formation in tubules, loss of brushy edge in tubule epithelium, vacuolization, shedding of epithelium into the lumen, presence of inflammation / fibrosis in interstitial structure, morphological changes in glomeruli were evaluated and scored. Biochemically, urea, creatine, total oxidant level, total antioxidant level, oxidative stress index, total thiol and native thiol levels, thiol-disulfide ratio, paraoxonase-1 level, ischemia modified albumin level were measured. Mann-Whitney U test, Kruskal-Wallis test, Dunn test, Wilcoxon signed-rank test, Friedman test and Pearson chi-square test were used for statistical analysis (SPSS version 20). Results: There was no statistical difference in the comparison of the blood gas parameters studied from the blood samples taken from the arterial line at the beginning of the groups, except for the values within the physiologic limits which were not thought to have an effect on the result. There was a statistically significant difference between the chlorine (p=0.02) and calcium (p=0.03) values of Group IR at baseline, 40 minutes after ischemia, 70 minutes after reperfusion and 100 minutes after reperfusion. There was a statistically significant difference between the baseline HCO3 level of Group C and the HCO3 level at 90 minutes of citrate infusion (p=0.04). There was a statistically significant difference between the baseline Ca level of Group C and the Ca level at 90 minutes after citrate infusion (p=0.03). There were statistically significant differences between the baseline Cl levels (p=0.009), Ca levels (p=0.002), lactate levels (p=0.01), glucose levels (p=0.008), HCO3 levels (p<0.001) and BE levels (p=0.004) of Group IR+C at baseline, 60 minutes after citrate infusion, 100 minutes after ischemia, 130 minutes of reperfusion and 160 minutes of reperfusion. Statistically significant differences were observed between creatine levels (p<0.001) and urea levels (p<0.001) of the four study groups. A statistically significant difference was observed between the histopathologic scores of the groups (p=0.001). Statistically significant differences were observed between TOS levels (p=0.048) and TAS levels (p=0.016), but no significant difference was observed between OSI values. A statistically significant difference (p<0.001) was found between T-thiol levels (p=0.002) and N-thiol levels. When thiol/disulfite levels were compared, the result was statistically significant (p<0.001). There was a statistically significant difference between the groups in terms of PON-1 levels (p<0.001) and IMA levels (p=0.001). Conclusion: In our study, we observed that IR injury caused oxidative damage in the kidneys. Sodium citrate infusion alleviated the oxidative damage by increasing the TAS level and decreasing the TOS level and contributed positively to the thiol/disulfide balance in the direction of thiols. In histopathological examinations, we observed that the preconditioning effect of citrate protected the kidney from IR injury. In conclusion, we believe that citrate may be useful in reducing the adverse effects of renal IR injury. Key words: Renal ischemia-reperfusion injury; Oxidative stress; TAS, TOS, OSI; Thiol/Disulfide Equilibrium; PON-1; IMA