NADP+ -Bağımlı Format Dehidrojenaz Enziminin Hesaplamalı ve Deneysel Yöntemlerle Moleku?ler Mu?hendisliği

Abstract

Format dehidrojenazlar (FDH, EC 1.2.1.2), nikotinamid adenin dinu?kleotid (NAD(P) kofatöru?nu? hidru?r (H-) transferi yoluyla indirgerken, format (HCOO-) iyonunun karbondioksite yu?kseltgenme reaksiyonunu katalizleyen enzimlerdir. İnce kimyasalların sentezlendiği proseslerde, koenzim geri dönu?şu?mu?nde (rejenerasyonunda) görev almaları nedeniyle önemli endu?striyel enzimlerden birisidir. FDH’ın katalitik mekanizmasında hidru?r transferi ve kofaktor bağlanmasının hız belirleyen en önemli basamaklar olması ve diğer dehidrogenaz katalizli reaksiyonlarda göru?len proton salma basamaklarını içermemesi; formatın dehidrojenaz substratları içerisinde en basit yapılı substrat olması, bu reaksiyonun moleku?ler mekanizma çalışmalarında model alınmasına sebep teşkil etmektedir. Doğal FDH’ların çoğunun NAD+ koenzimine ilgisinin yu?ksek olması, FDH’ın NADH rejenerasyonu için yaygın olarak kullanılmasını sağlarken, NADPH rejenerasyonu için kullanımını kısıtlamaktadır. Bu projede, Burckholderia sp. den elde edilmiş (Bsp383FDH) ve kristal yapısı aydınlatılmış olan NADP-spesifik format dehidrojenaz kullanılarak ve moleku?ler mu?hendislik yoluyla hem deneysel hem de hesapsal yöntemler kullanılarak Bsp383FDH enziminin kofaktör bağlanmasına etki eden aktif bölge amino asitlerin etkilerininin incelenmesini içermektedir. Bu sayede yapı-fonksiyon ilişkisinin moleku?ler seviyedeki etkileşimleri incelenmiştir. Bu enzimin NADP+ seçiciliği ve etkinliği ve rasyonel mutant dizaynının NADP+ bağlanmasına olan etkileri, hesaplamalı kimya yöntemleri kullanılarak araştırılmıştır. Elde edilen sonuçlara göre bağlanma bölgesinin en önemli amino asiti (Q223) doygun mutasyon yöntemiyle diğer aminoasitlere çevrilerek kinetik parametler hasaplanmıştır. Elde edilen sonuçlara göre, Bsp383FDH bilinen diğer format dehidrogenazların aksine nikotinamid kofatörlerinden NADP+ yi NAD+ ye tercih etmektedir. Böyle bir özelliğin olması bu?yu?k ölçu?de kofaktör bağlanma bölgesinde bulunan glutamin aminoasitinin varlığından kaynaklanmaktadır (Q223). Bu projede, Q223 pozisyonundaki glutamin aminoasiti, teorik çalışmalar eşliğinde mutasyon teknikleri kullanılarak (doygun veya yönlendirilmiş) mu?mku?n olan tu?m aminoasitler ile yer değiştirilmiştir. Oluşturulan mutant enzimlerden aktivite gösteren tu?m mutantların rekombinant u?retimi, saflaştırılması ve kinetik çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Elde edilen sonuçlar, doğal tip enzimle karşılaştırılmıştır. Karşılaştırmalar, NADP+, NAD+ ve format (hem NADP+ hemde NAD+ ortamında) yönu?nden kinetik parametreleri hesaplanarak (KM, kcat ve kcat/KM) incelenmiştir.