Genetic manipulation of shikimate and ehrlich pathway genes involved in acute polystyrene toxicity in saccharomyces cerevisiae

Abstract

Polistiren, yaygın olarak kullanılan petrokimyasal temelli bir plastik çeşididir. Doğada zor bozunabilen yapısı nedeniyle çevrede uzun süre kalıcılığını korur ve canlı organizmalar üzerinde olumsuz biyolojik etkiler yaratabilir. Özellikle nano boyuttaki polistiren parçacıklar, hücresel düzeyde çeşitli toksik etkiler oluşturarak organizmaların metabolik dengesini bozabilir. Bu çalışmada, model organizma olarak kullanılan Saccharomyces cerevisiae üzerinde, polistiren nanoparçacıkların potansiyel toksik etkileri değerlendirilmiş ve bu etkilere karşı hücresel stres toleransını etkileyebilecek genetik faktörler araştırılmıştır. Çalışmada, polistirenin neden olduğu toksisiteye karşı maya hücresinin verdiği yanıtları anlamak amacıyla, özellikle amino asit metabolizmasında görevli olan ARO4, ARO9 ve ARO10 genleri hedef alınmıştır. Bu genler, hem hücrenin temel metabolik faaliyetlerinde rol oynayan hem de çevresel stres faktörlerine karşı savunma mekanizmalarının parçası olabileceği düşünülen genlerdir. Genetik müdahaleler kapsamında bu genler için CRISPR-Cas9 sistemiyle gen nakavtı yapılmış, aynı zamanda rekombinant DNA teknolojisiyle aşırı ekspresyon sağlayan suşlar da oluşturulmuştur. Böylece, hem genlerin susturulması hem de yüksek seviyede ifade edilmeleri durumunda hücresel stres yanıtlarındaki değişimler karşılaştırmalı olarak değerlendirilmiştir. Bu kapsamda oluşturulan genetiği değiştirilmiş S. cerevisiae suşları, 25 nm boyutunda ve 250 mg/L konsantrasyonunda polistiren nanoparçacıklarla muamele edilmiştir. Deney gruplarında; vahşi tip suş, ARO4, ARO9 ve ARO10 genlerinin nakavt edildiği suşlar ile bu genlerin aşırı ifade edildiği suşlar yer almıştır. Toksisiteye bağlı stres tepkilerinin belirlenebilmesi amacıyla, büyüme eğrileri ve hücre canlılığı analizleri yapılmıştır. Hücre canlılığı değerlendirmesinde metilen mavisi boyama yöntemi kullanılmıştır. Elde edilen verilere göre, polistiren nanoparçacıklara maruz bırakılan genetiği değiştirilmiş suşlarda, büyüme eğrileri açısından vahşi tip suşla karşılaştırıldığında anlamlı bir fark gözlenmemiştir. Bu durum, polistirenin doğrudan büyüme hızına ciddi bir baskı oluşturmadığını göstermektedir. Ancak, metilen mavisi boyası ile yapılan hücre canlılığı ölçümlerinde, genetik olarak manipüle edilen bazı suşlarda hücresel canlılık oranlarında minimal bir artış tespit edilmiştir. Özellikle genlerin aşırı ifade edildiği suşlarda bu artış daha belirgindir. Bu sonuçlar, ARO gen ailesinin üyelerinin polistiren kaynaklı stres koşullarında hücreyi kısmen koruyucu bir rol üstlenebileceğine işaret etmektedir. Buna rağmen, gözlemlenen koruyucu etkinin sınırlı düzeyde kalması, polistirenin oluşturduğu toksisitenin çok daha karmaşık hücresel mekanizmalarla bağlantılı olduğunu düşündürmektedir. Stres yanıtı sadece belirli genlerin düzenlenmesiyle değil, aynı zamanda hücrenin genel metabolik dengesini, zar geçirgenliğini, redoks homeostazını ve protein katlanma süreçlerini etkileyen çok yönlü bir sistemle kontrol edilmektedir. Dolayısıyla, ARO genlerinin tek başına bu sistemi tamamen düzenlemesi mümkün değildir. Bu çalışma aynı zamanda, çevresel toksinlerin hücreler üzerindeki etkilerini sadece fenotipik düzeyde değil, genetik ve moleküler düzeyde değerlendiren yaklaşımların önemini vurgulamaktadır. Çevresel biyoteknoloji ve toksikoloji alanlarında bu tür sistematik analizler, toksik etkilere karşı dirençli organizmaların tasarlanması açısından büyük önem taşımaktadır. Tez kapsamında kullanılan CRISPR-Cas9 sistemi, S. cerevisiae'de genetik manipülasyonların hızlı ve etkili bir şekilde gerçekleştirilmesini sağlamış ve bu teknolojinin toksikoloji araştırmalarında kullanılabilirliğini göstermiştir. Ayrıca, bu çalışmada kullanılan yaklaşım, ileriye dönük olarak farklı çevresel stres faktörlerine karşı hücresel yanıtların araştırılmasına da temel oluşturabilir. Ağır metaller, farklı plastik türleri veya oksidatif ajanlar gibi toksik bileşiklerin etkileri de benzer genetik müdahalelerle analiz edilerek daha kapsamlı bir stres yanıt haritası oluşturulabilir. Bu sayede, hem çevresel kirliliğin organizmalar üzerindeki etkisi daha net anlaşılabilir hem de biyoteknolojik uygulamalarda kullanılabilecek dayanıklı mikroorganizma suşları geliştirilebilir. Sonuç olarak, bu tez çalışması ile S. cerevisiae'nin polistiren nanoparçacıklara karşı verdiği yanıtlar genetik düzeyde değerlendirilmiş, stres koşullarına karşı ARO4, ARO9 ve ARO10 genlerinin potansiyel rolleri ortaya konmuştur. Elde edilen bulgular, çevresel kirleticilere karşı hücresel savunma mekanizmalarının anlaşılmasına katkı sunmakta; aynı zamanda bu bilginin çevresel biyoteknoloji, toksikoloji ve sürdürülebilir mikrobiyal üretim alanlarında uygulanabilirliğine dair önemli ipuçları vermektedir.Polystyrene is a widely used petrochemical plastic and has a long-term persistence due to its structure that is difficult to decompose in the environment and can cause toxic effects on biological organisms. In this context, this study on polystyrene toxicity on the model organism Saccharomyces cerevisiae is based on the evaluation of the toxic effects of polystyrene on this yeast and the determination of potential genetic targets that may affect cellular stress tolerance against toxicity and the manipulations targeting various metabolic pathways at the gene level. In particular, the ARO4, ARO9 and ARO10 genes, which have role in amino acid metabolism in yeasts, were focused on. In these genes, both knockout using the CRISPR and overexpression of the genes using strategies based on recombinant DNA technologies were achieved. Genetically modified strains were treated with 25nm and 250mg/L PS and their possible effects on cell stress tolerance were investigated by growth curves and cell viability analyses. According to the results, while no significant difference was observed in the growth curves for knockout and overexpression strains, when the cell count results with methylene blue were compared with the wild type strain, it could be said that cellular stress tolerance to polystyrene was minimally increased in gene manipulated strains. In this context, this thesis contributes to the literature in terms of understanding the genetic responses of S.cerevisiae to environmental toxic agents and sheds light on the potential applications of genetic engineering approaches in areas such as environmental biotechnology, toxicology and sustainable microbial production.