Target-based inhibitor discovery: Computational strategies and analog inhibitors against KRAS mutants

Abstract

Yaşamın temel birimleri olan hücreler, canlılıklarını, işlevselliklerini sağlayabilmek ve vücut içerisindeki görevlerini yerine getirebilmek için oldukça organize sinyal ağlarına sahiptirler. Bu organize sinyal ağları aracılığıyla hücreler, gerekli durumlarda dış uyaranlara yanıt verebilir, büyüyebilir, farklılaşabilir ve programlanmış hücre ölümünü (apoptoz) gerçekleştirebilirler. Ras protein ailesi, hücrenin kilit moleküler düzenleyicilerinden olan küçük GTP (Guanozin trifosfat) bağlayıcı proteinlerin bir alt ailesidir ve hücre içi sinyal yollarında merkezi bir görev almaktadır. Ras proteinleri, hücre iskeleti organizasyonu, hücre içi sinyal iletimi, gen ekspresyon düzenlenmesi, hücre döngüsünün ilerlemesi, çoğalma ve farklılaşma dahil olmak üzere çeşitli hücresel fonksiyonlarda rol oynamaktadır. Ras proteinleri, aktif ve inaktif durumlar arasında geçiş yapan moleküler anahtarlar olarak işlev görmektedir. İnaktif formda Ras, GDP ile (Guanozin difosfat) bağlıyken, aktif formda GTP ile (Guanozin trifosfat) bağlıdır. Bu nükleotid değişim döngüsü, GDP'nin GTP ile değişimine yardımcı olan guanin nükleotid değişim faktörleri (GEF'ler) ve GTP hidrolizini hızlandıran GTPaz aktive edici proteinler (GAP'ler) tarafından sıkı bir şekilde düzenlenmektedir. Ras, GTP nükleotidi ile bağlanıp aktif duruma geçtikten sonra çeşitli efektör proteinlerle (Raf, PI3K, RALGDS) etkileşime girmektedir ve sinyalleri aşağı akış yoluna iletmektedir. Böylelikle Ras, büyümeyi düzenleyen hayati hücresel yolları kontrol eder. Dolayısıyla Ras'ın aktif/inaktif döngüsündeki bir bozulma, yalnızca tek bir enzimin problemi olmanın ötesine geçerek karmaşık bir ağ bozulması şeklinde değerlendirilmelidir. Ras protein ailesi, üç homolog izoform gen tarafından kodlanan proteinlerden oluşmaktadır: bunlar, KRAS (Kirsten Rat Sarcoma Virus), HRAS (Harvey Rat Sarcoma Virus) ve NRAS (Neuroblastoma RAS Viral Oncogene) genleridir. KRAS izoformunun, KRAS4A ve KRAS4B olmak üzere iki ekleme varyantı vardır. GTP bağlanma bölgesini içeren G-alanının (G-domain) ilk 80 amino asidi, tüm Ras homolog proteinlerinde neredeyse aynıdır ve bu durum da korunmuş bir işlevsel çekirdeğe işaret etmektedir. Aynı zamanda, bu homolog proteinlerin arasındaki C-terminal bölgelerinin farklılıkları, membran lokalizasyonu ve post-translasyonel modifikasyonlar gibi belirgin fonksiyonel çeşitlilik oluşturmaktadır. Yapısal çalışmalar, G-alanının GDP-GTP değişimi sırasında önemli konformasyonel değişikliklere uğradığını ve MAPK (Mitojenle Aktifleştirilen Protein Kinaz), PI3K (Fosfoinozitid 3-Kinaz), Raf (Rapidly Accelerated Fibrosarcoma) ve Ral (Ras-like) gibi spesifik efektör proteinlerin bağlanıp çoğalma sinyallerini iletmesine olanak sağladığını göstermektedir. Ras proteini yapısal olarak iki ana bölgeye ayrılmaktadır: Aktif (anahtar) bölge ve Allosterik bölge. Ras, yapısal aktivitesini belirleyen birkaç temel yapısal motif içermektedir: P-döngüsü (Fosfat bağlama döngüsü, aa 10-17), Anahtar I bölgesi (aa 30-40) ve Anahtar II bölgesi (aa 58-72). Bu bölgeler, GTP veya GDP'nin bağlı olup olmamasına göre konformasyonel değişikliklere uğramaktadır. Özellikle Anahtar I ve II bölgeleri, efektör proteinler için ana bağlanma cebini oluşturmaktadır ve aynı zamanda küçük molekül inhibitörleri için birincil hedef bölgelerdir. Allosterik bölgeler ise (özellikle aa 87-171), çekirdek yapıyı stabilize eder, GTPaz aktivitesinin düzenlenmesinde kritik bir rol üstlenir ve konformasyonel dinamikleri etkileyerek efektör etkileşimlerinin sürekliliğini belirlemektedir. Bu bölgeler, GTP hidrolizinin katalitik çevresini dolaylı olarak şekillendirmektedir ve aynı zamanda allosterik inhibitörler için potansiyel hedef bölgeleri oluşturmaktadır. Son yıllarda X-ışını kristalografisi, NMR ve kriyo-elektron mikroskobi gibi tekniklerin sağladığı yüksek çözünürlüklü yapısal veriler, bu allosterik bölgelerde geçici olarak oluşan veya yalnızca belirli konformasyonlarda ortaya çıkan "geçici ceplerin" de ilaç tasarımı açısından değerlendirilebileceğini göstermektedir. Böylece Ras proteini, yalnızca klasik nükleotid bağlanma bölgesine sahip küçük bir GTPaz olmaktan çıkıp, yapısı ilaç tasarımıyla dinamik bir hedef olarak yeniden tanımlanmaya başlanmıştır. Normal fizyolojik koşullar altında Ras aktivasyonu geçicidir ve GEF ile GAP proteinleri tarafından sıkı bir şekilde düzenlenmektedir. Ancak, Ras genindeki nokta mutasyonları, proteini GTP'ye bağlı, sürekli aktif formunda kilitleyebilir. Bu durum, MAPK ve PI3K gibi yollar aracılığıyla sürekli aşağı akış sinyalizasyonuna yol açarak kontrolsüz hücre büyümesi sonuçlu tümöre neden olur. Raf protein ailesi (ARAF, BRAF, CRAF/RAF1), bir serin/treonin kinaz ailesidir. Raf proteinin N-terminalinde Ras bağlanma bölgesi (RBD) mevcuttur. Ras bağlanması ile Raf'ı plazma membranına toplar, Raf'ın konformasyonunu değiştirerek dimerleşmesini ve fosforilasyonunu kolaylaştırır. Raf proteini de bu sayede MEK1/2 (MAP2K1/2) - ERK1/2 (MAPK1/3) hattını durmadan fosforlamaktadır. PI3K kinazının ise p110 alt biriminde RBD mevcuttur. PI3K kinazının sürekli aktif edilmesiyle PIP3 (Phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate) düzeyi yükselir ve AKT proteini (Protein Kinase B; PKB) etkilenerek membrana gelir. PDK1 (3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1) ve mTORC2 (Mechanistic Target of Rapamycin Complex 2) tarafından fosforlanıp aktifleşerek apoptozu baskılar ve hücre büyümesini artırmaktadır. Kapsamlı genomik analizler, Ras gen ailesindeki mutasyonların tüm insan kanserlerinin yaklaşık %30'unda görüldüğünü ve bu nedenle Ras'ın en sık mutasyona uğrayan onkogenlerden biri olduğunu ortaya koymaktadır. Bu ailede yer alan başlıca üç homolog gen (KRAS, NRAS ve HRAS) onkojenik dönüşümde farklı roller üstlenmektedir. Bunlar arasında KRAS mutasyonları, Ras kaynaklı mutasyonların yaklaşık %85'ini oluşturur ve özellikle pankreas adenokarsinomlarının %90'ından fazlasında, kolorektal kanserlerin yaklaşık %40'ından ve akciğer adenokarsinomlarının yaklaşık %30'undan sorumludur. NRAS mutasyonları ise toplam Ras mutasyonlarının yaklaşık %10-15'ini oluşturur. Bu mutasyonlar özellikle melanom, akut miyeloid lösemi (AML), akut lenfoblastik lösemi (ALL) ve bazı tiroid kanseri alt tiplerinde daha sık gözlenir. HRAS mutasyonları ise diğer homolog mutasyonlarına kıyasla yaklaşık %1-5'ini oluşturarak daha nadirdir, ancak mesane kanseri, baş-boyun skuamöz hücreli karsinomları ve servikal kanser gibi belirli tümörlerde anlamlı bir şekilde rapor edilmektedir. En yaygın nokta mutasyonlar, Ras'ın GTPaz aktivitesini bozan ve inaktivasyonunu engelleyen 12., 13. ve 61. kodonlarda meydana gelmektedir. Bu mutasyonlar GTP'nin hidrolizini bloke ederek proteini sürekli aktif GTP-bağlı durumda tutar ve böylece hücresel proliferasyon, farklılaşma ve hayatta kalma sinyallerini kesintisiz hale getirir. KRAS'ta özellikle G12D, G12V, G12C gibi mutasyonlar öne çıkarken, NRAS'ta Q61R ve Q61K, HRAS'ta ise G12S ve G13R mutasyonları sık görülmektedir. Çeşitli KRAS mutantları arasında, yüksek sıklıkları ve klinik önemleri nedeniyle en çok G12D ve G12C mutasyonları ön plandadır. KRAS G12D mutasyonu, 12. pozisyonda glisin amino asidinin aspartik asit amino asidi ile yer değiştirmesinden kaynaklanır ve bu mutasyon tipi pankreas duktal adenokarsinom (PDAC) vakalarının yaklaşık %45'inde görülmektedir. Öte yandan, glisin amino asidinin sistein amino asidi ile yer değiştirdiği KRAS G12C mutasyonları, akciğer adenokarsinomlarında daha yaygın görülmektedir. KRAS'ın G12C mutantını hedef alan kovalent inhibitörlerin keşfi, onkolojide büyük bir gelişmeyi temsil etmektedir. Bu kovalent inhibitörler, Switch II cebinin yakınında bulunan 12. pozisyondaki sistein rezidüsüne kovalent olarak bağlanarak KRAS'ı inaktif GDP-bağlı durumunda kilitler. Kovalent inhibitör örnekleri arasında, önemli klinik etkinlik gösteren ve hedefli KRAS tedavilerinin önünü açan Sotorasib (AMG 510), Adagrasib (MRTX 849) ve ARS-1620 inhibitörleri bulunmaktadır. Ancak, KRAS G12D için inhibitörlerin geliştirilmesi çok daha zorlu olmuştur. G12D mutasyonunda reaktif bir sistein rezidüsü bulunmadığından, geleneksel kovalent inhibitör stratejileri uygulanamamaktadır. Glisinin aspartik asitle yer değiştirmesi, potansiyel bir kovalent bağlanma bölgesini ortadan kaldırmaktadır ve aspartik asidin karboksilat yan zinciri, nükleofilik saldırı için kimyasal olarak uygun değildir. Bu nedenle, KRAS G12D'nin inaktif formuna seçici olarak bağlanıp stabilize edebilen kovalent olmayan inhibitörlerin tasarımı, son araştırmaların odak noktası haline gelmiştir. Son çalışmalar, KRAS'ın G12D mutantını hedef alan birkaç umut verici kovalent olmayan inhibitör tanımlamıştır. MRTX-1133, TH-Z827 ve TH-Z835 gibi kovalent olmayan moleküllerin, KRAS'ın inaktif GDP-bağlı formunu stabilize ederek ve Raf, PI3K gibi aşağı akış sinyal yolu efektörlerinin aktivasyonunu önleyerek KRAS'ı inhibe ettiği gösterilmektedir. Bu bileşikler, Anahtar II cebini yüksek afiniteyle işgal etmektedir. Sinyal yayılımı için gerekli etkileşimleri yer doldurarak önlemektedir ve böylece tümör hücresi çoğalmasını baskılamaktadır. Kovalent ve kovalent olmayan inhibitörlerin geliştirilmesine rağmen KRAS zorlu bir ilaç hedefi olmaya devam etmektedir çünkü Ras proteinin yüzeyinde küçük molekülleri barındırabilecek derin hidrofobik ceplerin bulunmaması nedeniyle, Ras onlarca yıl boyunca "ilaçla tedavi edilemez" olarak sınıflandırılmaktaydı. Aynı zamanda, Ras, GTP ve GDP'ye pikomolar afiniteyle bağlanarak potansiyel inhibitörlerin etkili bir şekilde rekabet etmesini zorlaştırmaktadır. Bütün bunlara ek olarak, birçok hastada tedaviye başlangıçta iyi yanıt alınsa da zamanla kazanılmış direnç mekanizmaları gelişmekte ve hastalığın yeniden ilerlemesi gözlenmektedir. Benzer şekilde, son yıllarda KRAS G12D mutasyonuna yönelik inhibitörlerin geliştirilmesinde önemli ilerlemeler kaydedilse de bu varyant için onaylı bir klinik ilaç henüz bulunmamaktadır. G12D inhibitör adaylarının preklinik ve erken faz klinik çalışmalarda umut verici sonuçlar göstermesine rağmen, direnç gelişimi riski bu mutasyon için de önemli bir endişe kaynağıdır. Dolayısıyla, KRAS mutasyonlarını hedefleyen mevcut tedavilerin ötesine geçilmesi, kombinasyon tedavi stratejilerinin geliştirilmesi, aktif veya yeni bağlanma bölgelerini hedefleyen alternatif inhibitörlerin tasarlanması ve allosterik mekanizmaları kullanan ilaç adaylarının klinik değerlendirmeye alınması büyük önem taşımaktadır. Bu yaklaşım, KRAS mutant tümörlerde daha kalıcı ve direnç gelişimine karşı daha dayanıklı yanıtların elde edilmesi açısından kritik bir adım olarak görülmektedir. Hesaplamalı ilaç keşfi, yapı tabanlı tasarım ve moleküler dinamik simülasyonlarındaki gelişmeler, Ras inhibitörleri arayışına metodsal yenilik getirmektedir. Bu hesaplamalı yaklaşımlar, geçici bağlanma ceplerini belirlenmesine ve proteinin dinamik doğasından yararlanan ligandlar tasarlanmasına olanak tanımaktadır. Bu tezin amacı, KRAS G12D ve G12C mutant varyantlarını hedef alan yeni aday inhibitörleri hesaplamalı yaklaşımlarla belirlemektir. Bu amaçla, çalışma grubumuz bünyesinde 2023 yılında yayınlanan 813197 numaralı yüksek lisans tez çalışmasında, G12D mutasyonu için küçük moleküllerden oluşan bir sanal kütüphane, en yüksek öngörülen bağlanma afinitesine sahip bileşikleri belirlemek için sanal tarama teknikleri kullanılarak KNIME programı ile taranmıştı. Önce ZINC20 veritabanı kullanılarak bir molekül kütüphanesi oluşturulmuş ve bu kütüphane KNIME programında Lipinski'nin Beş Kuralı ile filtrelenerek kurala uymayan moleküller elenmişti. Literatürde bildirilen bilinen inhibitörler pozitif kontrol inhibitörleri olarak tercih edilmiş ve bu moleküllere yapısal benzerlik gösteren ve Lipinski kuralına uyan moleküller, kovalent olmayan kenetlenme çalışmaları için AutoDock Vina yazılımı kullanılarak daha ileri analizlere tabi tutulmuştu. Sanal kütüphanenin oluşturulması aşamasında, ilaç benzeri özelliklere sahip bileşiklerin seçilebilmesi için Lipinski kuralları ve ilgili diğer farmakokinetik filtreler dikkate alınmıştı. Böylece tarama adımı, yalnızca teorik olarak güçlü bağlanma afinitesi sunan değil, aynı zamanda potansiyel klinik aday olma niteliği taşıyan molekülleri ön plana çıkarmayı hedeflemişti. Sanal tarama aşaması sonrasında, 2023 yılında çalışma grubumuzdan yayınlanan 813197 numaralı tezin devamı olarak, bu tez kapsamında en iyi kenetlenme skoru veren molekülün, moleküler dinamik simülasyonlarının ve enerji hesaplamalarının gerçekleştirilmesi amaçlandı. Kenetlenme aşamalarının ardından, G12D mutasyonu için seçilen umut verici ligand-protein kompleksi, zaman içindeki kararlılığını, bağlanma etkileşimlerini, davranışlarını ve konformasyonel esnekliklerini değerlendirmek için moleküler dinamik (MD) simülasyonlarına tabi tutuldu. Bu hesaplamalı analizler, proteinin aktif bölgesindeki hidrojen bağlarının, hidrofobik temasların kalıcılığının yanı sıra protein-ligand kompleksinin genel yapısal stabilitesi hakkında değerli bilgiler sağladı. Moleküler dinamik (MD) simülasyonların sonucunda daha ileri hesaplamalı analizler için serbest enerji hesaplamaları ve çapraz korelasyon analizleri gerçekleştirildi. Aynı zamanda yüksek bağlanma afinitesine sahip analog alternatif moleküller geliştirmek için, aday bileşiğin fizikokimyasal özellikleri ve hedef bağlanma cebi ile etkileşimleri değerlendirildi. Bu değerlendirme, hidrojen bağı potansiyeli, hidrofobik etkileşimler ve ligand ile KRAS G12D proteininin bağlanma bölgesi arasındaki elektrostatik uyumluluk gibi temel faktörlerin değerlendirilmesini içermektedir. Bu analizlerin sonuçlarına dayanarak, aday bileşiğin moleküler yapısını optimize etmek için rasyonel fonksiyonel grup modifikasyonları uygulandı. Bu modifikasyonlar uygulanırken 3 farklı yöntem; ChEMBL veritabanında mevcut deneysel olarak denenmiş modifikasyon kuralları, Tanimoto metodu ile benzerlik araştırması ve kullanılan aracın 1,4 milyon kimyasal kuralın öğretildiği yapay zekasının ürettiği moleküller kullanıldı. Aktif bölge ve allosterik bölgeye göre molekül üzerinde farklı fonksiyonel gruplar modifiye edildi. İki ayrı bağlanma bölgesine göre oluşturulan bu analog moleküller, kenetlenme aşaması gerçekleştirilerek protein ile bağlanma afinitileri değerlendirildi. Molekül kütüphanelerinde en iyi ilk 10 skoru veren moleküller bir sonraki aşamaya taşındı. Modifiye edilmiş moleküller daha sonra, kararlılıklarını, bağlanma davranışlarını ve zaman içindeki potansiyel konformasyonel değişimlerini incelemek ve inhibitör etkinlikleri hakkında daha derinlemesine bilgi alabilmek için KRAS G12D yapısıyla kenetlenme analizi ve moleküler dinamik simülasyonlarına tabi tutuldu. Moleküler dinamik simülasyonlar sonucunda simülasyon boyunca aktif bölgeye bağlı kalan analog moleküllerin enerji hesaplamaları gerçekleştirildi. KRAS G12C mutasyonu için yeni kovalent inhibitörlerinin keşfedilmesi için sanal tarama aşamaları KNIME programında gerçekleştirildi. ZINC20 veritabanında molekül kütüphanesi oluşturulurken reaktif moleküller tercih edildi. Pozitif kontrol inhibitörleri olarak Sotorasib, Adagrasib ve ARS-1620 inhibitörleri seçildi ve Cresset Flare programı ile kovalent kenetlenme yöntemi uygulandı. En iyi skoru veren moleküller, proteinin bağlanma bölgesindeki etkileşime girdiği rezidülere göre değerlendirildi. Bu tez çalışmasının genel amacı, KRAS mutantları ile potansiyel inhibitörler arasındaki moleküler etkileşimleri açıklığa kavuşturarak hedef bazlı tedavi stratejilerinin geliştirilmesine katkıda bulunmaktır. Hesaplamalı modellemeyi moleküler yerleştirme ve dinamiklerle bütünleştirerek, bu araştırma gelecekteki deneysel doğrulamalar için temel olabilecek ilaç benzeri molekülleri belirlemeyi amaçlamaktadır. Ayrıca, bu çalışma, modern tıbbi kimyada hesaplamalı ilaç keşif metodolojilerinin artan önemini vurgulamaktadır. Hesaplamalı araçlar, erken aşama ilaç tasarımında avantajlı yaklaşımlardır ve geleneksel yüksek verimli tarama yöntemlerine kıyasla hem zamandan hem de maliyetten önemli ölçüde tasarruf sağlamaktadır. Sanal tarama, kenetlenme ve moleküler dinamik simülasyonlarının birleşimi sayesinde araştırmacılar, bağlanma afinitelerini tahmin edebilir, moleküler etkileşimleri optimize edebilir ve biyolojik testler için en umut verici adaylara öncelik verebilirler. Özetle, Ras protein ailesi, özellikle KRAS, birçok insan kanserinde önemli bir onkojenik etkendir. Bu proje, potansiyel inhibitör adaylarını belirlemek ve analiz etmek için hesaplamalı yaklaşımlar kullanarak KRAS'ı hedeflemeyle ilgili zorlukların üstesinden gelmeye odaklanmaktadır. Sonuçların, KRAS inhibisyonunun yapısal temelinin daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunması ve mutant KRAS izoformlarını seçici olarak hedeflemeyi amaçlayan yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesini desteklemesi beklenmektedir.The Ras protein family, encoded by NRAS, HRAS, and KRAS homolog genes, comprises small GTP-binding proteins that function as switches, alternating between active GTP-bound and inactive GDP-bound states to regulate signaling, cell division, and proliferation. Their conserved G-domain, the first 80 residues of which are highly conserved across homologs, contains P-loop (aa 10-17), Switch I (aa 30-40), and Switch II (aa 58–72) motifs. Oncogenic mutations, particularly at codons 12, 13, and 61, hold Ras in the active conformation and maintain constant downstream signaling. RAS mutations are found in about 30% of human cancers, with KRAS representing 85% of them and causing colorectal, pancreatic, and lung adenocarcinomas. Although RAS was considered "undruggable," the presence of a pocket between Switch I/II has enabled direct inhibition; covalently binding small molecules for KRAS G12C (Sotorasib and Adagrasib) and non-covalent for G12D (MRTX-1133) bind to the pocket near the mutated 12th amino acid and stabilize the inactive conformation. Patients developed resistance to known inhibitors over time, and molecules targeting G12C mutant cannot benefit patients with G12D mutation, leading to a search for new inhibitors. The aim of this thesis is to discover a new candidate drugs for the G12C mutant using virtual screening and covalent docking, and to examine binding behavior of the molecule discovered in thesis number 813197 for the G12D mutant, by performing molecular dynamics simulations and energy calculations. Furthermore, the aim is to create more stable analogs of the G12D mutant inhibitor by modification. This work aims to guide future experimental validation efforts.