CRISPR/Cas 9 Genom Düzenleme Teknolojisi Kullanılarak Fare Modelinde Implantasyon Sürecini Kontrol Eden Genlerin Ortaya Çıkarılması

Abstract

İmplantasyon başarısızlığı embriyonun endometriyuma invazyonu ile birlikte embriyonun trofoektoderm hücrelerinden salgılanmaya başlanan koryonik gonadotropinin hiç salgılanmaması veya salgılanması ancak gebelik kesesi oluşmaması durumudur. Yardımla üreme tekniklerine (YÜT) ihtiyaç duyulmayan spontan gebeliklerde dahi ilk denemede implantasyon başarısızlığı olma ihtimali %25-40 arasındadır. Bu projede genom düzenlenmesi konusundaki etkinliği kanıtlanmış olan CRISPR/Cas9 yöntemi ile implantasyonda etkinliği olan genlerin aktivitesi, birbirlerini ile olan etkileşimi, zamana ve hücre tipine bağlı değişkenliği, in vitro koşullardaki etki değişikliği, implantasyon üzerine etkisinin ortaya konulması hedeflenmiştir. Bu hedef doğrultusunda in vitro üç boyutlu olarak oluşturulmuş kültür ortamında farklı deney gruplarında inkübe edilen blastokistlerden 24. ve 72. Saatlerde örnekler alınmış, örneklerde RNA dizi analizi yapılmış ve etkin olan genler ortaya konulmuştur. Dizi analizi sonucunda etkin olduğu belirlenen her gen için blastokist, endometriyum epitel ve endometriyum stroma hücreleri ayrı ayrı susturulmuş ve her grup için in vitro implantasyon parametreleri incelenmiştir. Elde edilen veriye göre endometriyum epitel hücrelerinde Hmga2 ve Gm15452; stroma hücrelerinde Tmem158, blastokistlerde GATA3 ve Tmsb4x genleri üzerinde çalışılmıştır. Bu genlerin etkin olarak susturabildiği gruplarda implantasyon parametreleri olarak belirlenen adezyon ve invazyon ile ilgili genlerle, gelişimsel ve fonksiyonel genlerde anlamlı değişiklikler gösterilmiştir. Epitel hücrelerinde Hmga2?nin susturulması ile LIF, MMP9, PR, entaktin, Timp3, Esr1, Muc1, Erbb1, Erbb2, Hoxa10 ve Wnt 4 genlerinin farklı zaman gruplarında anlamlı olarak değiştiği, Epitel hücrelerinde Gm15452?nin susturulması sonrasında LIF, MMP9, PR, entaktin, TIMP3, fibronektin, laminin, Esr1, Muc1, Erbb1, Erb2, Wnt 4 ifadelerinde anlamlı olarak değiştiği, Stroma hücrelerinde Tmem158?in susturulması ile Pr, entaktin, Timp3, Fibronektin, Esr1, Muc1, Erbb1, Erbb2, Hoxa10, Wnt4 ifadelerinin anlamlı olarak etkilendiği belirlenmiştir. Blastokistlerde de Tmsb4x ve Gata3 genleri susturulmuş olup, iki genin de invazyon ve gelişimde rol alan genlerle ilişkili olduğu gözlemlenmiştir. Anahtar Kelimeler: İmplantasyon, fare, RNA dizileme, CRISPR/Cas9, 3B kültür, in vitro