Acanthamoeba’nın Hızlı Tespiti için 18S rRNA Genine Özgü Hızlı Döngü Aracılı İzotermal Amplifikasyon (LAMP) Testinin Geliştirilmesi ve Hassasiyetinin Belirlenmesi

Abstract

Amaç: Serbest yaşayan amiplerden biri olan Acanthamoeba, başta su, toprak ve hava olmak üzere birçok çevresel örnekte tespit edilmiştir. Acanthamoeba’nın neden olduğu en önemli klinik tablolar içinde Acanthamoeba keratiti ve granülomatöz amibik ensefalit bulunmaktadır. Bu çalışmada klinik ve çevresel örneklerde Acanthamoeba’nın varlığının daha hızlı bir şekilde saptanabilmesi için Acanthamoeba 18S rRNA gen bölgesine özgü primerler ile geliştirilen hızlı döngü aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP) testinin hassasiyetinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Yöntemler: Kültürde çoğaltılan Acanthamoeba spp. suşu 200 ?L’de 1x106 trofozoit olacak şekilde sulandırılıp DNA izolasyonu yapılarak DNA miktarı Nano-Drop Spektrofotometre ile belirlenmiştir. Saflaştırılan DNA’lar 1000 pg’den 0,001 pg’ye kadar seyreltilip, kolorimetrik ve floresan tabanlı iki farklı LAMP reaksiyonunda kullanılmıştır. LAMP reaksiyon karışımı toplam 25 ?L hacimde 63 °C’de 60 dk olacak şekilde inkübe edilmiştir. Bulgular: Geliştirilen testlerin hassasiyetinin saptanmasında elde edilen Acanthamoeba spp. genomik DNA’sını hem kolorimetrik hem de floresan tabanlı LAMP testlerinde 1, 10, 100 ve 1000 pg/reaksiyon pozitiflik gözlenmiştir. Hem kolorimetrik hem de floresan LAMP testinin en düşük analitik hassasiyeti 1 pg/reaksiyon olarak tespit edildi. Ayrıca, testin özgüllüğünü değerlendirmek için diğer parazit DNA’ları ile uygulanan LAMP reaksiyonu sonucunda kolorimetrik ve %1’lik agaroz jel elektroforezinde pozitif kontrol dışında LAMP ürünü tespit edilmemiş olup, geliştirilen testin özgüllüğü %100 olarak tespit edilmiştir. Sonuç: Acanthamoeba’nın 18S rRNA gen bölgesi hedef alınarak geliştirilen LAMP testinin 1 pg genomik DNA saptama limitine sahip olduğu ortaya konulmuştur. LAMP testinin kültür yöntemine göre daha hassas ve hızlı olmasının yanı sıra basit, ucuz ve yüksek hassasiyete sahip olması umut vericidir. Bu nedenle geliştirilen testin çevresel ve klinik örneklerde Acanthamoeba spp. tanısı için uygulanabileceği düşünülmektedir.