Investigation of the potential therapeutic effect of endoplasmic reticulum stress and apoptotic mechanism triggered by epibrassinolide in combination with tamoxifen in MCF-7 and MDA-MB-231 breast cancer cells

Abstract

Meme kanseri, dünya genelinde başlıca ölüm nedenidir ve 2020'de 2,3 milyon vaka bildirilmiştir. Dolayısıyla, bu artan bir küresel sağlık sorunudur. Meme kanseri hormon reseptörlerinin varlığına göre kategorize edilir. Östrojen reseptör pozitif alt tiplerinden biridir. Örneğin, MCF-7 hücre hattı östrojen, progesteron ve HER2 reseptörlerini içerir. Tamoksifen (TAM) östrojen reseptörü pozitif hastaların tedavisinde sıkça kullanılan bir kemoterapi ilacıdır. Çalışma mekanizması östrojen reseptörüne bağlanarak östrojen reseptörü sinyal yolağı aracılığıyla gerçekleşen proliferasyonu ve tümör büyümesini engeller. TAM'a uzun süre maruz kalan hücrelerde direnç gelişir. Üçlü negatif meme kanseri olarak bilinen MDA-MB-231 hücre hattında östrojen, progesteron ve HER2 reseptörleri bulunmamaktadır. Direnç tedaviden önce var olabilir (de novo) veya ilaca uzun süre maruz kalmanın sonucu olarak kazanılabilir. Üç farklı sinyal iletim yolu bulunan endoplazmik retikulum (ER) stresi ilaç direnci gelişiminde rol oynar. ER stres, yanlış katlanmış ya da katlanmamış proteinlerin ER lümeninde birikmesi durumunda ortaya çıkar ve bu da katlanmamış protein yanıtını tetikler. Katlanmamış protein yanıtı, anahtar düzenleyicilerin aktivitelerinde değişikliklere neden olarak sonunda hücrelerin kaderini belirler. Epibrasinolid (EBR) bitki büyüme düzenleyicisi olan brassinosteroidlerin bir üyesi olup doğal olarak meydana gelen bir bitki steroid hormonudur. EBR'nin birçok kanser türünde anti-kanser özellikleri bulunmaktır. Bu çalışmada amacımız EBR'nin TAM ile kombine tarafından tetiklenen ER stresi aracılığıyla apoptozun potansiyel terapötik etkilerinin meme kanseri hücre hatlarında değerlendirmekti. Bu amaçla EBR ve TAM'ın hücre canlılığı üzerindeki etkisi doz ve zamana bağlı olarak incelendi ve meme kanseri hücre hatlarının canlılığını sinerjistik olarak azalttı. Sonrasında, TAM ve EBR'nin uygulanmasıyla 2D ve 3D 'de koloni oluşturma kapasitesini ciddi bir şekilde engelledi. TAM ile EBR'nin kombinasyonuna maruz kaldıktan sonra DNA parçalanması arttı ve mitokondriyal membran potansiyeli azaldı. Hücre döngüsü analizine göre ölü hücreleri gösteren subG1 oranı kombine tedavi ile önemli ölçüde arttı. İmmünoblotlama sonuçları, TAM ve EBR kombine olarak verildiğinde ER stres ve apoptoz belirteçlerinin anlatım ifadelerinin arttığını gösterdi. İlaç direnci belirteçlerinin ifadeleri ise azaldı. Endoplazmik retikulum stres inhibitörü olan tauroursodeoksikolik asit (TUDCA) kombinasyon tedavisinin ER stres tarafından oluşturulduğunu kanıtlamak için kullanıldı. Sonuç olarak, bulgularımız EBR'nin hem hormon duyarlı hem de hormon duyarsız meme kanseri hücre hatlarında TAM'a karşı duyarlılığını arttırdığını göstermektedir.Breast cancer (BC) remains the primary cause of death globally, with 2.3 million cases reported in 2020 alone, marking it as an escalating global health issue. BCs are classified according to the presence or absence of hormone receptors. One of the subtypes includes estrogen-receptor-positive tumors. For instance, MCF-7 cell line exhibits the expression of estrogen receptor, progesterone receptor (PR), and HER2. Tamoxifen (TAM) is frequently used as a chemotherapy drug in the treatment of patients with estrogen receptor-positive tumors. It competes with estrogen to bind the estrogen receptors, thereby hindering proliferation and tumor growth through estrogen receptor signaling. Nevertheless, prolonged exposure to TAM leads to the development of resistance, representing a significant drawback in cancer treatment. MDA-MB-231 cell line represents triple negative BC, characterized by the absence of estrogen receptor, PR, and HER2 expression, resulting in a resistant profile for the cell line. This resistance can be de novo existed before treatment or acquired resulted from prolonged exposure to the drug. The development of chemoresistance encompasses the involvement of three distinct branches of endoplasmic reticulum (ER) stress signaling pathways. ER stress occurs when misfolded or unfolded proteins accumulate in the lumen of the ER, prompting the unfolded protein response (UPR). The UPR initiates the changes in the activities of key regulators, ultimately determining the fate of the cells. Epibrassinolide, a member of brassinosteroids, which is a plant growth regulator, is a naturally occurring plant steroid hormone. It has anti-cancer properties in several types of cancer. Our purpose was to evaluate the potential therapeutic effects of the ER stress-mediated apoptosis triggered by the combination of EBR with TAM in BC cell lines. To achieve this purpose, the combined treatment of TAM with EBR synergistically reduced the viability of BC cell lines in both a dose- and time-dependent manner. Then, the colony-forming capacity was hindered dramatically in 2D and 3D by administering the TAM and EBR. After exposure to the combination of TAM with EBR, DNA fragmentation increased, and mitochondrial membrane potential decreased. According to the cell cycle analysis, the subG1 ratio which indicates dead cells was remarkably enhanced by the combined treatment. Immunoblotting results revealed that the combination of TAM with EBR led to an increase in the expression of ER stress and apoptosis biomarkers. Conversely, the expression of drug resistance markers was reduced. Moreover, tauroursodeoxycholic acid (TUDCA), which is an ER stress inhibitor, was used to prove the effect of the combination treatment caused by ER stress. Lastly, our immunoblotting results showed that the alterations in the expression of ER stress, apoptosis and drug resistance markers were reversed in the presence of TUDCA. In conclusion, our findings indicate that co-administration of EBR enhances the sensitivity to TAM in both hormone-sensitive and insensitive BC cell lines.